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熒光原位雜交 |
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熒光原位雜交 簡介 熒光原位雜交方法是一種物理圖譜繪製方法，使用熒光素標記探針，以檢測探針和分裂中期的染色體或分裂間期的染色質的雜交。 熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)是在20世紀80年代末在放射性原位雜交技術的基礎上發展起來的一種非放射性分子細胞遺傳技術,以熒光標記取代同位素標記而形成的一種新的原位雜交方法,探針首先與某種介導分子(reporter molecule)結合,雜交後再通過免疫細胞化學過程連接上熒光染料.FISH的基本原理是將DNA(或RNA)探針用特殊的核苷酸分子標記,然後將探針直接雜交到染色體或DNA纖維切片上,再用與熒光素分子偶聯的單克隆抗體與探針分子特異性結合來檢測DNA序列在染色體或DNA纖維切片上的定性、定位、相對定量分析.FISH具有安全、快速、靈敏度高、探針能長期保存、能同時顯示多種顏色等優點,不但能顯示中期分裂相,還能顯示於間期核.同時在熒光原位雜交基礎上又發展了多彩色熒光原位雜交技術和染色質纖維熒光原位雜交技術.。應用背景 對於利用rRNA的熒光原位雜交來說，如下原因可導致較低的熒光信號強度： 較低的細胞核醣體含量 較低的細胞周邊的通透性 較低的目標序列可接觸性（由於rRNA的折疊產生的構象，有些位置與rRNA分子內其他鍊或其他rRNA或蛋白緊密接觸，從而使探針無法和目標序列雜交） 為檢驗細胞中的目標序列是否容易被探針雜交，及測試最佳雜交溫度，可利用“克隆熒光原位雜交”(clone-FISH)進行試驗：將rRNA基因結合入質粒，轉化至大腸桿菌中表達，構成核醣體，再用熒光標記的探針雜交。 FISH可與流式細胞術聯用，對特定熒光標記的細胞進行計數或者分離。 [1] 變體 酶聯熒光原位雜交(CARD-FISH) 熒光原位雜交（FISH）技術詳解 1974年Evans首次將染色體顯帶技術和染色體原位雜交聯合應用，提高了定位的準確性。 20世紀70年代後期人們開始探討熒光標記的原位雜交，即FISH技術。 1981年Harper成功地將單拷貝的DNA序列定位到G顯帶標本上，標誌著染色體定位技術取得了重要進展。 20世紀90年代，隨著人類基因組計劃的進行，由於繪製高分辨人類基因組圖譜的需要，FISH技術得到了迅速的發展和廣泛應用。 原理 FISH(fluorescence in situ hybridization)技術是一種重要的非放射性原位雜交技術。它的基本原理是:如果被檢測的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA與所用的核酸探針是同源互補的，二者經變性-退火-复性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。將核酸探針的某一種核苷酸標記上報告分子如生物素、地高辛，可利用該報告分子與熒光素標記的特異親和素之間的免疫化學反應，經熒光檢測體系在鏡下對待測DNA進行定性、定量或相對定位分析。 實驗流程 FISH樣本的製備→探針的製備→探針標記→雜交→（染色體顯帶）→熒光顯微鏡檢測→結果分析。 特點 原位雜交的探針按標記分子類型分為放射性標記和非放射性標記。用同位素標記的放射性探針優勢在於對製備樣品的要求不高，可以通過延長曝光時間加強信號強度，故較靈敏。缺點是探針不穩定、自顯影時間長、放射線的散射使得空間分辨率不高、及同位素操作較繁瑣等。採用熒光標記系統則可克服這些不足，這就是FISH技術。 FISH技術作為非放射性檢測體系，有以下特點。 優點:1、熒光試劑和探針經濟、安全；2、探針穩定，一次標記後可在兩年內使用；3、實驗週期短、能迅速得到結果、特異性好、定位準確；4、FISH可定位長度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當；5、多色FISH通過在同一個核中顯示不同的顏色可同時檢測多種序列；6、既可以在玻片上顯示中期染色體數量或結構的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結構。 缺點：不能達到100%雜交，特別是在應用較短的cDNA探針時效率明顯下降。 應用 該技術不但可用於已知基因或序列的染色體定位，而且也可用於未克隆基因或遺傳標記及染色體畸變的研究。在基因定性、定量、整合、表達等方面的研究中頗具優勢。 FISH最初用於中期染色體。從正在分化的細胞核中製備的這種染色體是高度凝縮的，每條染色體都具有可識別的形態，它們染色後將顯現出特徵性的著絲粒位置及染色帶型。在處理中期染色體時，通過測定FISH所獲得熒光信號相對於染色體短臂末端的位置（FLpter值）來進行作圖。使用中期染色體的不足之處在於，由於它的高度凝縮的性質，只能進行低分辨率作圖，兩個標記至少分隔1Mb才能作為分開的雜交信號被分辨出來（Trask et al.，1991） 。這種分辨率不足以構建有交往的染色體圖譜。故此中期染色體FISH主要用於確定新標記在染色體上的大概位置，為其他更精細的作圖方法做準備。一直以來，這些“其他方法”並不包括任一種FISH，但1995年後，一系列高分辨率的FISH技術已發展起來。這些技術通過改變待研究的染色體製備的性質而達到較高的分辨率。中期染色體對於精細作圖來說凝縮度太高，因而我們需要選用較為伸展的染色體。有兩種途徑可以滿足這一要求（Heiskanen et al.，1996）： 機械伸展的染色體（mechanically stretched chromosome）通過改變從中期細胞核中分享染色體的方法而獲得。離心產生剪切力可將染色體伸展到正常長度20倍。每條染色體仍可識別，而FISH信號作圖方法與通常處理的中期染色體相同，這樣，分辨率可明顯提高，能夠區分出相隔200~300kb的標記。非中期染色體（non-metaphase chromosome）染色體僅在中期高度凝縮，而在細胞週期的其他階段保持天然未包裝狀態，有研究者曾利用前期細胞核，此時染色體凝縮程度足以區分出單個染色體。實際應用中，這種方法並無優於機械伸展的染色體之處。相比之下分裂間期（interphase）的染色體更為有用，因為分裂間期（再次細胞核分裂之間）的染色體包裝程度最低。使用分裂間期的染色體，分辨率有可能達到25kb以下，但染色體形態特徵消失，推動了定位探針位置所需的外部參照點。因此，該技術可在已獲得染色體粗略圖譜後使用，通常作為確定染色體一段小區域內一系列標記物順序的方法。間期染色體含有去組裝的全部的細胞DNA分子。為了進一步提高FISH的分辨率到25kb以下，有必要放棄完整的染色體，而使用純化的DNA。這種方法叫做纖維-FISH（fiber-FISH），利用凝膠拉伸或分子梳理技術製備DNA，可以分辨間距小於10kb的標記。 [2] 熒光原位雜交技術的發展歷程 FISH 技術檢測位點數目及檢測目標的發展 在FISH 技術基本確立之後，FISH 不僅用於單基因或核酸檢測，FISH 技術的進一步發展擴展到多色FISH 多基因位點同時檢測，從基因檢測發展到基因組、染色體、活細胞中轉錄產物mRNAs 原位檢測以及組織水平的核酸檢測，並且在今後的研究中還有可能應用到整個生物體的檢測。早期的探針較大，是通過載體的增殖、缺口平移法、體外轉錄法和隨機引物DNA 合成法來製備以獲得特異性雜交克隆。然而大片斷的探針通常帶有重複序列造成高熒光背景，採用未標記的核酸進行預處理使其與非特異性位點結合用於抑制非特異性雜交可以克服上述問題，同時也使得研究者擴大了檢測目標，實現了整條染色體染色。在細胞遺傳學上FISH 技術在染色體分析方面也因此得到了顯著的提高。如通過比較基因組雜交（Comparativegenomic hybridization）用於檢測染色體區域的缺失和重複。大片段探針一旦和样品非特異性結合就會形成一個信號，混淆染色體上基因的檢測，就需要剪切成小片段<200核苷酸。現在檢測手段的提高以及檢測軟件的不斷發展使得FISH技術的檢測要求越來越低，靈敏度越來越高。精確的計算機圖片處理算法的不斷改進形成了亞顯微水平的探針高分辨技術。隨著檢測目標越來越小，FISH技術已用於隱蔽的亞端粒核型基因重排和精確的染色體作圖及單拷貝mRNA的檢測。 FISH 檢測範圍的擴大，使得FISH 技術的應用在20 世紀90 年代急速增長。由FISH 技術應用而形成的分支技術實現了越來越多的不同類型位點同時檢測。首先是採用不同的熒光素來檢測多位點，如雙色熒光用於檢測特異的核酸序列，每一條染色體、基因或者轉錄產物分別由一種可以分辨的熒光信號來表示。之後是採用兩種色彩譯碼方案進一步擴大了FISH 應用範圍。譯碼方案主要是針對色彩比例，即每一種顏色在總顏色中所佔的比例來描繪多位點。前述的每一種方法，或是兩種方法的結合都已經將可檢測位點多達12 個。採用計算機翻譯的五色方案可同時檢測出人類所有染色體代表著FISH 技術多位點檢測的里程碑。儘管可以採用多種方法觀測到mRNAs，但是FISH 對整個轉錄產物的原位分析似乎更有應用前景。色彩譯碼技術已經實現了對整個組織的檢測。 |
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