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內含子 |
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雙內含子：細胞器RNA pre-tRNA中的內含子：細胞核，pre-tRNA（真核） 其中，1類內含子的剪接主要是轉酯反應，剪接反應實際上是發生了兩次磷酸二酯鍵的轉移。第一個轉酯反應由一個游離的鳥苷或鳥苷酸（GTP、GMP或GDP）介導，其3'-OH作為親核集團攻擊內含子5'端的磷酸二酯鍵，從上游切開RNA鏈，在第二個轉酯反應中，上游外顯子的自由3'-OH作為親核基團攻擊內含子3'位核苷酸上的磷酸二酯鍵，使內含子完全被切開，上下游兩個外顯子通過新的磷酸二酯鍵重新連接。2類內含子切除體系中，轉酯反應無需游離鳥苷酸或鳥苷，而是由內含子本身的靠近3'端的腺苷酸2'-OH作為親核基團攻擊內含子的5'端的磷酸二酯鍵，從上游切開RNA後形成套索裝結構。再由上游外顯子的自由3'-OH作為親核基團攻擊內含子3'位核苷酸上的磷酸二酯鍵，使內含子被完全切開，上下游兩個外顯子通過新的磷酸二酯鍵重新連接。 作用 內含子（introns）在轉錄後的加工中， 從最初的轉錄產物除去的內部的核苷酸序列。術語內含子也指編碼相應RNA內含子的DNA中的區域。內含子可能含有“舊碼”，就是在進化過程中喪失功能的基因部分。正因為內含子對翻譯產物的結構無意義，它比外顯子累積有更多的突變。大多數真核結構基因中的間插序列（interveningsequence）或不編碼序列。它們可以轉錄，但在基因轉錄後，由這些間插序列轉錄的部分（也可用內含子這個術語表示）經加工被從初級轉錄本中準確除去，才產生有功能的RNA。基因的編碼部分稱外顯子。內含子常比外顯子長，且占基因的更大比例。真核基因所含內含子的數目、位置和長度不盡相同，如雞卵清蛋白基因的外顯子被7個內含子隔開，雞卵伴清蛋白基因有17個內含子， α-珠蛋白基因有2個內含子，卵粘蛋白基因有6個內含子等。內含子（Interveningregion）是一個基因中非編碼DNA片斷，它分開相鄰的外顯子。更精確的定義是：內含子是阻斷基因線性表達的序列。 DNA上的內含子會被轉錄到前體RNA中，但RNA上的內含子會在RNA離開細胞核進行轉譯前被剪除。真核生物的基因含有外顯子和內含子，是前者區別原核生物的特徵之一。內含子在選擇性剪接扮演重要角色，一個基因可以因此而產生多種不同的蛋白質。 第一類內含子 一類新的可動因子即第一類內含子（groupIintron）已被發現，它們廣泛在於各種生物的線粒體、葉綠體及基因組內，內含子移動分內含子回歸（intronloss）和內含子轉座（imtrontransposition），前者已為實驗證實，後者則尚未被證實。 第一類內含子可動現象的發現和被步研究 1975年，人們以啤酒酵母菌mt-DNA某些突變為標記進W XW－雜交，發現W 傳遞到了代的比例為95%而W－幾乎為零，現像上好似發生了單方賂基因轉變（ unidirectionalgeneconversion）。從W-到W ，由於W 中有內含子ScLDU． 1，而W-則無，故人們認為上述現象與該內含子有關。順序分析發現該內含子中存在一個可讀框PRF，起始於AUG，共長235個密碼子，為確定該產物的生化功能，人們以內含子上下游的一些富含GC的順序作為探針來研究W XW－雜交中兩不同階段的mtDNA，即：（1）合子剛形成時的mt-DNA，此時雙親的mt－DNA同時存在於一個細胞中；（2）幾個細胞世代以後，當細胞是同質體時的mt-DNA。通過對W XW－的子代中的同質體克隆的觀察發現，內含子ScLSU．在子代中的傳遞效率高達95%，恰好與W 情況相吻合，而mt-DNA上遠離ScLSU．內含子發生了單方向基因轉變，而且在單方向基因轉變同時還發生距該內含子上下游幾百bp範圍的側翼DNA順序的共轉變，其頻率隨距內含子的距離的增加而減小。 而當研究W XW－中的合子剛形成時的mt-DNA時，發現在無內含子（intronless）LSU基因的內含子插入位發生一個雙鏈斷裂，該斷裂將隨合子的長大而消失，推測與內含子插入引起的DNA修復有關。同時，當Wd突變體和無內含子的野生型雜交時，發現沒有內含子的單方向基因轉變發生，核苷酸順序分析表明Wd突變原因是在內含子ORF的不同位置發生了移碼突變、無義突變和多個鹼基置換，說明該內含子的翻譯產物在I－（intronless）基因的雙鏈斷裂形成中起著直接或間接的作用，1986所有人用通用遺傳密碼構建了一個等同於ScLSU． 1內含子ORF的順序，發現它在E． coli中能表達為一個內切核酸酶，並可高度特異地切割帶內含子切割序的mt-DNA，該識別順序共長18bp，切割後可產生4bp伸出的3'－OH末端以插入內含子，而內含子一旦插入到無內含子順序後，該順序就被分割成兩部分，無法再為內切核酸酶識別，從而可陰止I 基因的自切割，使基因變均表現為單方向的，即從I 到I－。通過對酵母W系統的研究可概括出第一類內含子可動的三個條件： （1）一個基因的兩種功能形式的存在，即I 和I－，且能通過雜交進行遺傳交換； （2）在內含子中要存在一咱ORF，並編碼有功能的雙鏈內切核酸酶； （3）在無內含子基因中存在呆為該內切梳酸酶識別的順序。 在W系統研究之後，人們通過許多雜交實驗又發現了一系列可動的第一類內含子，例Chlamydomonaseugametos的cp-DNA中的CeLSU． 5、Saccharomycescererisiae中的Sccox1.4，T4噬菌體中的T4td.1和T4aunY． 1，Physarumpolycephalum的PpLSU． 3及Neurosporacrassa中的含子Ncnd1，1等。 第一類內含子可動的可能機制 第一類內含子DNA的內部ORF表達，產生一個雙鏈內切核酸酶，該酶識別無內含子的同一基因上的順序並結合上去，酶切產生具有4bp伸出析3'－OH末端的雙鏈斷裂，然後以I 基因的未切割的同源順序作為模板來修復雙鏈斷裂，該修復機制延伸到側翼區域，導致共轉變，而內含子一旦插入後，它本身既可產生內切核酸酶，也可作為修復斷裂的模板，從而使整個過程可不斷進行。 內含子轉座也通過相同的過程進行，由於內切核酸酶識別順序可存在於三種位置：（1）同一基因的拷則；（2）不同基因；（3）基因間區域，這三種情況下的內含子插入，導致三種不同結果，第一種情況在內含子插入後產生內含子回歸；第二種導致轉座，因為插入新位點的內含子進行有效的RNA剪接；第三種情況也導致轉座，但由於插入的內含子DNA無法轉錄，故它將經隨機突變而消失。同時，在雙鏈斷裂的修復中，切點周圍的順序和未切割模板的外顯順序之間的同源性對修復亦很重要，同源性越高，修復效率越高。所以，內含子回歸很常見，而內含子轉座則很少見。 另處，內含子轉座也可通過RNA中介進行，基因Gl（I ）經轉錄和自剪接產生被切下來的內含子RNA，該RNA通過反向剪接整合到另一個基因G2（I－ ）中，再經逆轉錄和重組，產生帶有I的G2，這種情況主要是在四膜蟲中發現的。 第一類內含子可動現作用和生物學意義 內含子DNA順序插入到一個新位置，應帶來它的轉錄和剪接問題，內含子回歸不存在這個問題，因為I 基因本身可正常轉錄和剪接。但是，就內含子轉坐而言，由於內含子本身無啟動子，其轉坐有賴於宿主基因，所以，內含子轉座常導致產生一個無活性的內含子，它將因無法時行有效轉錄而通過隨機突變在進化中消失，故內含子轉座的頻率很低。 同時，當內含子插入到某一基因後，要保持該基因的正常功能，就必須有效的進行RNA剪接，第一類內含子的剪接和內含子的IGS（internalguidesequence）順序與上游外顯子之間鹼基配對的相互作用有關，故一個成功的內含子插入依賴於該內含子能夠與新的基因相匹配。同時，資料表明，許多第一類內含子的上游外顯子有短的保留下游外顯子沒有，故推測可能內含子發生轉座後，可通過隨機突變或特異的複制機來適應新的回歸位點，以獲得與外顯子的正確匹配，從而成為一個成功的內含子轉座，當然，轉座中外顯子的共轉變或外顯子通過隨機突變而適應新插入的內含子兩種方式同樣也能提高內含子和外顯子的匹配，提高內含子轉座的成功率。既然單方向內含子插入的頻率及高，I－等位基因為何未在群體中消失呢？一種解釋是：I 基因是近期出現的，並將隨時間推移取代所有I－等位基因；另一種解釋認為是自然不利於含有內含子的細胞的生長；而目前更多的人認為是內含子回歸和丟失之間的平衡維持第一類內含在細胞世代穩定存在，只要插入到合適的位置後能進行有效的轉錄和剪接，同時不給細胞帶來任何新的表型。在S． cerevisiae中，mt－內含子的剪接功能缺陷型是呼吸缺陷的，而這些內含子發生缺失後就可得到呼吸正常的野生型表型的回复子，故人們推測內含子丟失的可能機制是：I RNA發生剪接，除去內含子，再反轉錄，並通過受體基因和cDNA外顯子順序之間的同源重組，導致內含子丟失，而實驗中發現第二類內含子和反轉錄病毒的逆轉錄酶有同源順序， 使人們猜想第一類內含子的丟失可能由第二類內含子的翻譯產物控制，1989年有人用mss18突變體證明了這一想法，因為實驗表明，第一類內含子Secoxl.5b的發生缺失需要第二類內含子Sccoxl． 1Sccoxl． 2的存在。 目前對大量的生物研究表明，大批內含子在生物中的分佈物不均衡，表示為（1）同一種的不同個體中，有的有內含子，有的沒有；（2）同一基因在不同種生物基因組中的內含子的特性，數目位置等不同，如Sccoxl． 2b和Ancoxl． 3是高度同源內含子插入在不同種的同一回歸位點的例子，這兩種內含子有70%順序相同，但內含子周圍的外顯子順序很不同，從而推測可能是內含子發生水平轉移的結果，而不同生物不同回歸位點有高度同源內含子存在的事實，如ScLSU． 1和Nccob.2也說明水平轉移的可能。總之，內含子在不同種或同一種的不同個體中的不同回歸位點分佈的不均可以用內含子回歸和內含子丟失之間的平衡來解釋，而在不回歸位點分佈的不均可以用回歸的內含子丟失之間的平衡來解釋，而在不同回歸位點上相似相關內含子的存在則可能是內含子轉座的結果。而且，如果這種內含子轉座是發生在極其不同的種之間的話，那麼，可能在轉移過程中還存在著某種未知形式的分子載體。當然，這還只是一種設想，有待於進一步的證實。 起源 內含子起源有兩種假說。 1．內含子與它所在的基因一樣古老，在裝配第一個這樣的基因時，內含子就已存在。早期的內含子具有自催化、自我複制等能力，因此，它們是原始基因和基因組的組織與復制必不可少的部分。而今天的原核生物和少數低等的真核生物，由於它們需要進行快速的DNA複製從而進行快速的細胞分裂，因而失去了內含子。現代的內含子是一類進化遺跡，它們之所以能繼續存在，是因為具有重新組合基因組中的外顯子以形成新的基因的能力，即內含子能賦予其攜帶者更大的進化潛力。 2．內含子不是基因原有的，而是在進化的某一過程中通過轉座作用插入到連續基因中去的，內含子在較高級的功能基因或在真核生物出現之後才產生。這種假說必鬚麵對一個難題，即內含子最初如何能插入到連續編碼的基因中而保持基因的功能不變。 |
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