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引物 |
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引物（primer），是一小段單鏈DNA或RNA，作為DNA複製的起始點，在核酸合成反應時，作為每個多核苷酸鏈進行延伸的出發點而起作用的多核苷酸鏈，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯鏈形式進行合成，因此引物的3′-OH，必須是游離的。 類型 存在有自然中生物的DNA複製引物（RNA引物）和聚合酶鍊式反應(PCR)中人工合成的引物（通常為DNA引物）。一般所說引物，指DNA引物，以下簡稱引物。 引物設計原則 引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個引物與感興趣區域一端的一條DNA模板鏈互補，另一個引物與感興趣區域另一端的另一條DNA模板鏈互補。在PCR（聚合酶鍊式反應）技術中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根據這一序列合成引物，利用PCR擴增技術，目的基因DNA受熱變性後解鍊為單鏈，引物與單鏈相應互補序列結合，然後在DNA聚合酶作用下進行延伸，如此重複循環，延伸後得到的產物同樣可以和引物結合。 PCR引物設計的目的是找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。如前述，引物的優劣直接關係到PCR的特異性與成功與否。對引物的設計不可能有一種包羅萬象的規則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助於引物的設計。 最佳設定區域 DNA序列的保守區是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件（比如DNAman）比對（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區。 長度 引物長度（primer length）常用的是18-27 bp，但不應大於38，因為過長會導致其延伸溫度大於74℃，不適於Taq DNA聚合酶進行反應。 GC含量Tm值 GC含量（composition）過高或過低都不利於引發反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度，一般高於Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G C） 2（A T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復性條件最佳。 3′端避開第3位 如擴增編碼區域，引物3′端不要終止於密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發生簡併，會影響擴增的特異性與效率。 選擇T 引物3′端錯配時，不同鹼基引發效率存在著很大的差異，當末位的鹼基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發鏈的合成，而當末位鍊為T時，錯配的引發效率大大降低，G、C錯配的引發效率介於A、T之間，所以3′端最好選擇T。 鹼基要隨機分佈 引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3'端相似性較高的序列，否則容易導致錯誤引發（False priming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種鹼基的分佈最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應超過3個連續的G或C，因這樣會使引物在GC富集序列區錯誤引發。 自身避免互補 引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成髮夾結構（Hairpin）使引物本身复性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的複性結合。引物自身不能有連續4個鹼基的互補。 兩引物之間也不應具有互補性，尤其應避免3′ 端的互補重疊以防止引物二聚體（Dimer與Cross dimer）的形成。引物之間不能有連續4個鹼基的互補。引物二聚體及髮夾結構如果不可避免的話，應盡量使其△G值不要過高（應小於4.5kcal/mol，∆G 值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結構內部鹼基對的相對穩定性[1]），否則易導致產生引物二聚體帶，並且降低引物有效濃度而使PCR 反應不能正常進行。 5′ 端中間G值應較高3′ 端較低 △G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結構內部鹼基對的相對穩定性，△G值越大，則雙鏈越穩定。應當選用5′ 端和中間△G值相對較高，而3′ 端△G值較低（絕對值不超過9）的引物。引物3′ 端的△G 值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構並引發DNA 聚合反應。 （不同位置的△G值可以用Oligo 6軟件進行分析） ′端可以修飾 引物的5′ 端決定著PCR產物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′ 端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、Eu3 等；引入蛋白質結合DNA序列；引入點突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。 引物的延伸是從3′ 端開始的，不能進行任何修飾。 3′ 端也不能有形成任何二級結構可能。 單鏈無二級結構 某些引物無效的主要原因是擴增產物單鏈二級結構的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結構區域。用有關軟件（比如RNAstructure）可以預測估計mRNA的穩定二級結構，有助於選擇模板。實驗表明，待擴區域自由能（△G°）小於58.6l kJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區域時，用7-deaza-2′-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。 特異性 |
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