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基因治療 |
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自殺基因 在某些病毒或細菌中的某基因可產生一種酶，它可將原無細胞毒或低毒藥物前體轉化為細胞毒物質，將細胞本身殺死，此種基因稱為“自殺基因” 。 免疫治療 免疫基因治療是把產生抗病毒或腫瘤免疫力的對應與抗原決定族基因導入機體細胞，以達到治療目的。如細胞因子(cytokine)基因的導入和表達等。耐藥治療 耐藥基因治療是在腫瘤治療時，為提高機體耐受化療藥物的能力，把產生抗藥物毒性的基因導入人體細胞，以使機體耐受更大劑量的化療。如向骨髓幹細胞導入多藥抗性基因中的mdr-1。 基因治療 1．基因轉移方法 （1）特異正常基因的分離與克隆：應用重組DNA和分子克隆技術結合基因定位研究成果，已有不少基因並將會有更多人類基因被分離和克隆，這是基因治療的前提，在當代分子生物技術條件下，一般來說，只要有基因探針和準確的基因定位，任何基因都可被克隆。除此，現在既可人工合成DNA探針，還可用DNA合成儀在體外人工合成基因，這些都是在基因治療前，分離克隆特異基因的有利條件。 （2）外源基因的轉移：基因轉移（gene transfer）是將外源基因導入細胞內，其轉移方法較多，常用的要有下列幾類： 1）化學法：將正常基因DNA（及其拷貝）與帶電荷物質和磷酸鈣、DEAE－葡萄糖或與若干脂類混合，形成沉澱的DNA微細顆粒，直接傾入培養基中與細胞接觸，由於鈣離子有促進DNA透過細胞有作用，某些化合物可擾亂細胞膜，故可將DNA輸入細胞內，並整合於受體細胞的基因組中，在適當的條件下，整合基因得以表達，細胞亦可傳代。這種方法簡單，但效率極低，一般1000－100000個細胞中只有一個細胞可結合導入的外源基因。要達到治療目的，就需要從病人獲得大量所需的受體細胞。當然，可以通過選擇培養的方法來提高轉化率。 2）物理法：包括電穿孔法和直接顯微注射法。 ①電穿孔法：電穿孔法（electroporotion）是將細胞置於高壓脈衝電場中，通過電擊使細胞產生可逆性的穿孔，周圍基質中的DNA可滲進細胞，但有時也會使細胞受到嚴重損傷。 ②顯微注射法：顯微注射（microinjection）是在顯微鏡直視下，向細胞核內直接注射外源基因，這種方法應是有效的。但一次只能注射一個細胞，工作耗力費時。此法用於生殖細胞時，有效率可達10%。直接用於體細胞卻很困難。在動物實驗中，應用這種方法將目的基因注入生殖細胞，使之表達而傳代，這樣的動物就稱為轉基因動物，目前成功使用得較多的是轉基因小鼠（transgenic mice），它可作為繁殖大量後代的疾病動物模型。 ③脂質體法：脂質體（liposome）法是應用人工脂質體包裝外源基因，再與靶細胞融合，或直接注入病灶組織，使之表達。 3）同源重組法：同源重組（homologous recombination）是將外源基因定位導入受體細胞的染色體上，在該座位因有同源序列，通過單一或雙交換，新基因片段替換有缺陷的片段，達到修正缺陷基因的目的。如在新基因片段旁組裝一Neo基因，則在同源重組後，因有Neo基因，可在含有新黴素（neomycin）的培養基中生長，從而使未插入新基因片段的細胞死亡。對於體細胞基因治療，體外培養細胞的時間不能過長，篩選量大，故在臨床上應用也受限制難以進行。今後如能改進技術，提高重組率，這種定點修正基因的方法仍是有前景的。 4）病毒介導基因轉移：前述的化學和物理方法都是通過傳染方式基因轉移。病毒介導基因轉移（viral mediatedgene transfer）是通過轉換方式完成基因轉移，即以病毒為載體（vector），將外源目的基因通過基因重組技術，將其組裝於病毒上，讓這種重組病毒去感染受體宿主細胞，這種病毒稱為病毒運載體（viral vector）。目前應用的有兩種病毒介導基因轉移方法。 ①反轉錄病毒載體：反轉錄病毒雖是RNA病毒，但有反轉錄酶，可使RNA轉錄為DNA，再整合到宿主細胞基因組。反轉錄病毒載體有以下的優點首先是具有穿透細胞的能力，可使近100%的受體細胞被感染，轉化細胞效率高；其次，它能感染廣譜動物物種和細胞類型而無嚴格的組織特異性；再者隨機整俁的病毒可長期存留，一般無害於細胞，但也存在缺點：這種載體只能把其DNA整合到能旺盛分裂細胞的染色體，而不適合於那些不能正常分裂的細胞，如神經元。最嚴重的問題是由於病毒自身含有病毒蛋白及癌基因，就有使宿主細胞感染病毒和致癌的危險性。因此，人們有目的地將病毒基因及其癌基因除去，僅留它們的外殼蛋白，以保留其穿透細胞的功能，試圖避免上述缺點。這種改造後的病毒稱為缺陷型病毒（defective virus）。這樣的病毒中的反轉錄酶可將RNA轉化為DNA，有助於該DNA順利進入宿主細胞的基因組，而該病毒則死亡。由於病毒整合基因組是隨機的，所以還是可能激活細胞的原癌基因，以及因隨機插入發生插入突變。 在反轉錄病毒載體中，最常用於人類的是莫洛尼（Mooney）鼠白血病病毒（murine leukemia virus;Mo-MLV），其人工構建的結構。 ②DNA病毒介導載體（DNA viral mekiated vector）：DNA病毒包括腺病毒、SV40、牛乳頭瘤病毒、皰疹病毒等，一般認為這類病毒難於改造成缺陷型病毒。 牛乳頭瘤病毒重組後，可不插入宿主染色體中引起插入突變，又可在宿主染色體外獨立復制，並表達出基因產物。有人發現，因缺少E1區而致複製缺陷的腺病毒，可在表達E1基因的細胞中繁殖。後來證明，載有外源DNA的複制缺陷腺病毒呈現相同繁殖的特點。 1993年美法等國成功採用腺病毒載體進行心、腦、肺、肝內膽管和肌肉組織的體內基因轉移。它代表了基因治療的新方向。 美國設計了一個新的腺病症載體，它是用一個化學連接器即賴氨酸鏈（lysine chain）將DNA栓在病毒外殼上，這樣組成的運輸器，通過一個表面抗體而進入細胞核，使宿主基因與治療基因共同表達。這個新病毒載體稱為腺病毒多賴氨酸DNA複合體（adeno virus-polylysine DNA-complex）。 採用複制缺陷的腺病毒進行基因治療有以下優點： ①該病毒可感染分裂和非分裂的細胞，並能得到大量基因產物，對神經細胞、心肌細胞等基因缺陷的糾正有特殊意義； ②病毒顆粒相對穩定，並易於純化和濃縮，且感染力不降低； ③可有效轉導多種靶細胞後而少游離於細胞基因組外，並持續表達； ④已用於基因治療的Ad5屬腺病毒C亞群，無致癌性。 前述的新腺病毒載體還有一大優點是可以成功地運載48000bp的基因，而其它病毒只能運輸70 00bp的基因。這些優點顯示了腺病毒介導載體的廣闊應用前景。 2．選擇靶細胞的原則 這裡所指的靶細胞是指接受轉移基因的體細胞。 |
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