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原位雜交 |
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原位雜交是指將特定標記的已知順序核酸為探針與細胞或組織切片中核酸進行雜交，從而對特定核酸順序進行精確定量定位的過程。原位雜交可以在細胞標本或組織標本上進行。另有熒光原位雜交。 基本定義 原位雜交（in situ hybridization）將標記的核酸探針與細胞或組織中的核酸進行雜交，稱為原位雜交！ 使用DNA或者RNA探針來檢測與其互補的另一條鏈在細菌或其他真核細胞中的位置。RNA原位核酸雜交又稱RNA原位雜交組織化學或RNA原位雜交。該技術是指運用cRNA或寡核苷酸等探針檢測細胞和組織內RNA表達的一種原位雜交技術。其基本原理是：在細胞或組織結構保持不變的條件下，用標記的已知的RNA核苷酸片段，按核酸雜交中鹼基配對原則，與待測細胞或組織中相應的基因片段相結合（雜交），所形成的雜交體(Hybrids）經顯色反應後在光學顯微鏡或電子顯微鏡下觀察其細胞內相應的mRNA、rRNA和tRNA分子。 RNA原位雜交技術經不斷改進，其應用的領域已遠超出DNA原位雜交技術。尤其在基因分析和診斷方面能作定性、定位和定量分析，已成為最有效的分子病理學技術，同時在分析低豐度和罕見的mRNA表達方面已展示了分子生物學的一重要方向。 FISH是原位雜交技術大家族中的一員，因其所用探針被熒光物質標記（間接或直接）而得名，該方法在80年代末被發明，現已從實驗室逐步進入臨床診斷領域。基本原理是熒光標記的核酸探針在變性後與已變性的靶核酸在退火溫度下复性；通過熒光顯微鏡觀察熒光信號可在不改變被分析對象（即維持其原位）的前提下對靶核酸進行分析。 DNA熒光標記探針是其中最常用的一類核酸探針。利用此探針可對組織、細胞或染色體中的DNA進行染色體及基因水平的分析。熒光標記控針不對環境構成污染，靈敏度能得到保障，可進行多色觀察分析，因而可同時使用多個探針，縮短因單個探針分開使用導致的周期過程和技術障礙。 例子 以菌落原位雜交為例： 對分散在若干個瓊脂平板上的少數菌落（100-200）進行克隆篩選時，可採用該方法。將這些菌落歸併到一個瓊脂主平板以及已置於第二個瓊脂平板表面的一張硝酸纖維素濾膜上。經培養一段時間後，對菌落進行原位裂解。主平板應貯存於4℃直至得到篩選結果。 將少數菌落轉移到硝酸纖維素濾膜上 （1） 在含有選擇性抗生素的瓊脂平板上放一張硝酸纖維素濾膜。 （2） 用無菌牙籤將各個菌落先轉移至濾膜上，再轉移至含有選擇性抗生素但未放濾膜的瓊脂主平板上。應按一定的格子進行劃線接種（或打點）。每菌落應分別劃線於兩個平板的相同位置上。最後，在濾膜和主平板上同時劃一個含有非重組質粒（如pBR322）的菌落。 （3） 倒置平板，於37℃培養至劃線的細菌菌落生長到0.5-1.0mm的寬度。 （4） 用已裝防水黑色繪圖墨水的注射器針頭穿透濾膜直至瓊脂，在3個以上的不對稱位置作標記。在主平板大致相同的位置上也作上標記。 （5） 用Parafilm膜封好主平板，倒置貯放於4℃，直至獲得雜交反應的結果。 （6） 裂解細菌，按本段下面所述方法，使釋放的DNA結合於硝酸纖維素濾膜。 菌落的裂解及DNA結合於硝酸纖維素濾膜 （1） 在一張保鮮膜上製作一個裝有0.5mol/L NaOH的小窪（0.75ml），使菌落面朝上，將濾膜放到小窪上，展平保鮮膜，使濾膜均勻濕潤，讓濾膜留於原處2-3分鐘。 （2） 用乾紙巾從濾膜的下方吸乾濾膜，用一張新的保鮮膜和新配製的0.5mol/L NaOH重複步驟（1）。 （3） 吸乾濾膜，將濾膜轉移到新的帶有1mol/L Tris·Cl(pH7.4）的保鮮膜窪上。 5分鐘後吸乾濾膜，再重複一次該步驟。 （4） 吸乾濾膜，把它轉移到有1.5mol/L NaCl、0.5mol/L Tris·Cl (pH7.4）的保鮮膜小窪上5分鐘後吸乾濾膜，轉移到一張乾的濾紙上，置於室溫20-30分鐘，使濾膜乾燥。 （5） 將濾膜夾在兩張乾的濾紙之間，在真空烤箱中於80℃幹烤2小時，固定DNA。 （6） 將固定在膜上的DNA與32 P標記的RNA進行雜交。 3.雜交（1） 盛有2×SSC的塑料盤同，將乾烤的濾膜飄浮在液面上，徹底浸濕5分鐘。 （2） 將濾膜轉到200ml預洗液的玻璃皿中。濾膜何疊在一起，放於溶液中。用保鮮膜蓋住玻璃皿，放到位於培養箱內的旋轉平台上。於50℃處理30分鐘。在這一步及以後的所有步驟中，應緩緩搖動濾膜，防止它們粘在一起。 （3） 用泡過預洗液的吸水棉紙輕輕地從膜表面拭去細菌碎片，以降低雜交背景而不影響陽性雜交信號的強度和清晰度。 （4） 將濾膜轉到盛有150ml預雜交液的玻璃中，在適宜溫度（即在水溶液中雜交時用68℃，而在50%甲酰胺中雜交時用42℃）下，預雜交1 -2小時。 （5） 將32 P標記的雙鏈DNA探針於100℃加熱5分鐘，迅速置於冰浴中。單鏈探針不必變性。將探針加到雜交袋中雜交過夜。雜交期間，盛濾膜的容器應蓋嚴，以防液體蒸發。 （6） 雜交結束後，去除雜交液，立即於室溫把濾膜放入大體積（300-500ml）的2×SSC和0.1% SDS溶液中，輕輕振搖5分鐘，並將濾膜至少翻轉一次。重複洗 一次，同時應避免膜乾涸。 （7）68℃用300-500ml 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜兩次，每次1-1.5小時。此時已可進行放射自顯影。如背景很高或實驗要求嚴格的洗膜條件，可用300-500ml 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液於68℃將濾膜浸泡60分鐘。 |
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