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原位雜交 |
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（8） 把濾膜放在紙巾上於室溫晾乾後，把濾膜（編號面朝上）放在一張保鮮膜上，並在保鮮膜上作幾個不對稱的標記，以使濾膜與放射性自顯影片位置對應。 （9） 用第二張保鮮膜蓋住濾膜。加X光片並加上增感屏於-70℃曝光12-16小時。 （10） 底片顯影后，在底片上貼一張透明硬紙片。在紙上標記陽性雜交信號的位置，同時在不對稱分佈點的位置上作出標記。可從底片上取下透明紙，通過對比紙上的點與瓊脂上的點來鑑定陽性菌落。應用 ①細胞特異性mRNA轉錄的定位，可用於基因圖譜，基因表達和基因組進化的研究； ②感染組織中病毒DNA/RNA的檢測和定位，如EB病毒mRNA、人類乳頭狀瘤病毒和鉅細胞病毒DNA的檢測； ③癌基因、抑癌基因及各種功能基因在轉錄水平的表達及其變化的檢測； ④基因在染色體上的定位； ⑤檢測染色體的變化，如染色體數量異常和染色體易位等； ⑥分裂間期細胞遺傳學的研究，如遺傳病的產前診斷和某些遺傳病基因攜帶者的確定，某些腫瘤的診斷和生物學劑量測定等。 意義 原位雜交：在研究DNA分子復制原理的基礎上發展起來的一種技術。其基本原理是兩條核苷酸單鏈片段，在適宜的條件下，能過氫鍵結合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA 雙鍵分子的特點，應用帶有標記的（有放射性同位素，如3H、35S、32P、熒光素生物素、地高辛等非放射性物質）DNA或RNA片段作為核酸探針，與組織切片或細胞內待測核酸（RNA或DNA）片段進行雜交，然後可用放射自顯影等方法予以顯示，在光鏡或電鏡下觀察目的mRNA或DNA 的存在並定位；用原位雜交技術，可在原位研究細胞合成某種多肽或蛋白質的基因表達。此方法有很高的敏感性和特異性，可進一步從分子水平來探討細胞的功能表達及其調節機制。已成為當今細胞生物學、分子生物學研究的重要手段。 原位雜交試驗 收集斑馬魚的胚胎，在Holfretor水中培養，到達所需要的發育時期時，用蛋白酶去除卵膜，用4%多聚甲醛固定，在4℃保存，二十四小時後用50%甲醇2%多聚甲醛溶液洗，然後換成甲醇，在-20C 保存，待用（兩天和兩天以上的胚胎需要用雙氧水處理，去除色素。或者使用苯锍脲稀溶液培養，可阻斷色素的形成） 原位雜交第一天 1. 重新水化和固定 1） 吸取固定好的胚胎，加入50%甲醇的PBST溶液，放置5分鐘。 2） 置換成30%甲醇的PBST溶液，放置5分鐘 3） 置換成PBST溶液，放置5分鐘，重複一次 4） 置換成4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘 5） 用PBST洗兩次，每次放置五分鐘，室溫。 蛋白酶處理與後固定（本實驗不做此步） 1） 用10ul/ml的蛋白酶K在室溫下處理胚胎。 5體節以下的胚胎不處理，5體節到24小時的胚胎處理3分鐘，24小時以上的胚胎處理5分鐘或者更長。發育時間越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶處理，發育時間長的胚胎就需要用蛋白酶來疏鬆組織，以便於雜交。 2） 用PBST溶液輕洗，在PBST中放置5分鐘。 3） 用4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘，室溫。 4） 用PBST洗兩次，每次放置五分鐘，室溫。 2. 預雜交 1）每個管中置換成大約300ulHYB－溶液，60℃水浴5分鐘，避免振盪。 2）用等體積的HYB 取代HYB－。 3）60℃水浴，預雜交4小時以上。 |
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