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引物 |
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引物設計完成以後，應對其進行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了。 值得一提的是，各種模板的引物設計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導致找不到各種指標都十分合適的引物；用作克隆目的的PCR，因為產物序列相對固定，引物設計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。做Real Time時,用於SYBR Green I法時的一對引物與一般PCR的引物,在引物設計上所要求的參數是不同的。引物設計的要求： ●避免重複鹼基，尤其是G. ●Tm=58-60度。 ●GC=30-80%. ●3'端最後5個鹼基內不能有多於2個的G或C. ●正向引物與探針離得越近越好，但不能重疊。 ●PCR擴增產物長度： 引物的產物大小不要太大，一般在80-250bp之間都可；80∼150 bp最為合適（可以延長至300 bp）。 ●引物的退火溫度要高，一般要在60度以上； 要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴增的存在。 而且引物設計時應該考慮到引物要有不受基因組DNA污染影響的能力，即引物應該跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區，這樣可以更有效的不受基因組DNA污染的影響。 做染料法最關鍵的就是尋找到合適的引物和做污染的預防工作。對於引物，你要有從一大堆引物中挑出一兩個能用的引物的思想準備---尋找合適的引物非常不容易。 關於BLAST的作用應該是通過比對，發現你所設計的這個引物，在已經發現並在GENEBANK中公開的不物種基因序列當中，除了和你的目標基因之外，還有沒有和其他物種或其他序列當中存在相同的序列，如和你的目標序列之外的序列相同的序列，則可能擴出其他序列的產物，那麼這個引物的特異性就很差，從而不能用。 設計軟件 ■Oligo 6 Oligo 6是目前使用最為廣泛的一款引物設計軟件，除了可以簡單快捷地完成各種引物和探針的設計與分析外，還具有很多其他同類軟件所不具有的高級功能： ● 已知一個PCR引物的序列，搜尋和設計另一個引物的序列； ●按照不同的物種對MM子的偏好性設計簡併引物； ● 對環型DNA片段，設計反向PCR引物； ●設計多重PCR引物； ●為LCR反應設計探針，以檢測某個突變是否出現； ●分析和評價用其他途徑設計的引物是否合理； ●同源序列查找，並根據同源區設計引物； ●增強了的引物/探針搜尋手段。設計引物過程中，可以"Lock"每個參數，如Tm值範圍和引物3'端的穩定性等； ● 以多種形式存儲結果；支持多用戶，每個用戶可保存自己的特殊設置。 ■Primer Premier 5.0 Primer Premier 5.0 是一種用來幫助研究人員設計最適合引物的應用軟件利用它的高級引物搜索引物數據庫巢式引物設計引物編輯和分析等功能可以設計出有高效擴增能力的理想引物也可以設計出用於擴增長達50kb以上的PCR產物的引物序列。 該軟件主要由GeneTank 序列編輯，Primer引物設計，Align 序列比較，Enzyme 酶切分析和Motif 基序分析等幾個主要功能板塊組成。 |
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