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藥敏試驗 |
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用藥敏實驗進行藥物敏感度的測定，以便準確有效的利用藥物進行治療。但由於藥敏試驗要求比較嚴格，條件比較高，僅僅在大中專院校或科研單位有條件的可以操作，一些養殖廠或一些門診難有條件進行藥敏試驗的操作。針對這個問題，農業部動物檢疫所青島易邦生物工程有限公司動物疫病診療中心經過幾年的總結和實踐，逐漸總結出幾套適合基層進行藥敏試驗的操作方法。目前，臨床微生物實驗室進行藥敏試驗的方法主要有紙片擴散法，稀釋法（包括瓊脂和肉湯稀釋法），抗生素濃度梯度法（E-test法），和自動化儀器等。簡介 體外抗菌藥物敏感性試驗簡稱藥敏試驗（AST），是指在體外測定藥物抑菌或殺菌能力的試驗。 根據美國國家臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)近期推薦的標準，對非苛氧菌（腸桿菌科細菌、銅綠假單胞菌、和其他非腸科桿菌、葡萄球菌屬細菌、腸球菌屬細菌）和苛氧菌（嗜血桿菌屬細菌、淋病奈瑟菌、肺炎鏈球菌和其他鏈球菌）選擇常規藥敏試驗的首選藥物（A 組抗生素）或臨床使用的主要抗生素（B組抗生素）進行藥敏試驗。 抗菌藥對細菌性傳染病的控制起到了非常重要的作用，但由於養殖過程中不科學的、盲目的濫用抗菌藥，很多致病性細菌產生了耐藥性，使得抗菌藥對細菌性疾病的控制效果越來越差，不但造成藥物浪費，而且還延誤病情，給養殖戶造成了很大的經濟損失。 隨著新型致病菌的不斷出現，抗菌藥的防治效果越來越差。並且各種致病菌對不同的抗菌藥物的敏感性不同，同一細菌的不同菌株對不同抗菌藥物的敏感性也有差異。長期以來，各種致病菌耐藥性的產生使各種常用抗菌藥物往往失去藥效，以及不能很好的掌握藥物對細菌的敏感度，所以一個正確的結果，可供臨床醫師選用抗菌藥物的參考，並提高療效。農業部動物檢疫所青島易邦生物工程有限公司動物疫病診療中心總結出幾套適合基層進行藥敏試驗的操作方法，現簡單介紹如下。 分類 紙片擴散法 該法是將含有定量抗菌藥物的濾紙片貼在已接種了測試菌的瓊脂表面上，紙片中的藥物在瓊脂中擴散，隨著擴散距離的增加，抗菌藥物的濃度呈對數減少，從而在紙片的周圍形成濃度梯度。同時，紙片周圍抑菌濃度範圍內的菌株不能生長，而抑菌範圍外的菌株則可以生長，從而在紙片的周圍形成透明的抑菌圈，不同的抑菌藥物的抑菌圈直徑因受藥物在瓊脂中擴散速度的影響而可能不同，抑菌圈的大小可以反映測試菌對藥物的敏感程度，並與該藥物對測試菌的MIC呈負相關。 稀釋法 稀釋法藥敏試驗可用於定量測試抗菌藥物對某一細菌的體外活性，分為瓊脂稀釋法和肉湯稀釋法。實驗時，抗菌藥物的濃度通常經過倍比（lg2）稀釋，能抑制待測菌肉眼可見生長的最低藥物濃度成為最小抑菌濃度（MIC），一個特定抗菌藥物的測試濃度範圍應該包含能夠檢測細菌的解釋性折點（敏感、中介和耐藥）的濃度，同時也應該包含質控參考菌株的MIC. 2.1 瓊脂稀釋法首先製備含抗菌藥物的瓊脂稀釋平板。再接種待測菌株，然後是結果判讀。 2.2 肉湯稀釋法 抗生素濃度梯度法 自動化儀器法 實驗步驟 實驗材料 普通營養瓊脂培養基：可去生化試劑店購買，做不同細菌的藥敏試驗可選擇不同的培養基，如做大腸桿菌的藥敏試驗可選擇普通營養瓊脂或麥糠凱培養基。做沙門氏菌可選擇血清培養基。 藥敏試紙：購買或自製（詳見實驗準備） 細菌：待做藥敏試驗的細菌 儀器：接種環、酒精燈、打孔器、牛津杯、移液器、滴頭 實驗準備 2.1 藥敏片的準備：購買或自製 2.1.1 製備方法：取新華1號定性濾紙，用打孔機打成6毫米直徑的圓形小紙片。取圓紙片50片放入清潔乾燥的青黴素空瓶中，瓶口以單層牛皮紙包紮。經15磅15-20分鐘高壓消毒後，放在37℃溫箱或烘箱中數天，使完全乾燥。 2.1.2 抗菌藥紙片製作：在上述含有50片紙片的青黴素瓶內加入藥液0.25毫升，並翻動紙片，使各紙片充分浸透藥液，翻動紙片時不能將紙片搗爛。同時在瓶口上記錄藥物名稱，放37℃溫箱內過夜，乾燥後即密蓋，如有條件可真空乾燥。切勿受潮，置陰暗乾燥處存放，有效期3-6個月。 2.2 藥液的製備（用於商品藥的試驗）：按商品藥的使用治療量的比例配製藥液；如商品藥百病消按其說明量治療量0.01%飲水，可按這個比例配製藥液，可取10毫克加入10毫升的水中混勻。此稀釋液即為用於做藥敏試驗的藥液。 實驗操作方法 3.1 藥敏片法 3.1.1 在“超淨台”中，用經（酒精燈）火焰滅菌的接種環挑取適量細菌培養物，以劃線方式將細菌塗佈到平皿培養基上。具體方式；用滅菌接種環取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點塗菌，以每點開始劃線塗菌至平皿的1/2。然後，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密佈於平皿。 （另：可挑取待試細菌於少量生理鹽水中製成細菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液塗佈於平皿培養基表面。要求塗佈均勻緻密，直接懸液法要把菌液濃度用生理鹽水或PBS調到0.5個麥氏標準再塗佈均勻。） 3.1.2 將鑷子於酒精燈火焰滅菌後略停，取藥敏片貼到平皿培養基表面。為了使藥敏片與培養基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片。為了使能準確的觀察結果，要求藥敏片能有規律的分佈於平皿培養基上；一般可在平皿中央貼一片，外周可等距離貼若干片（外周一般可貼七片），每種藥敏片的名稱要記住。 |
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